免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。
注意：在準備做磷酸（酯）酶實驗的時候，不加磷酸酯酶抑制劑。
一.工作液配制：
配制100ml的modified RIPA buffe：
1、稱取790mg的Tris-Base，加到75ml去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用 HCl調節PH值到7.4；
2、加10ml 10%的NP-40；
3、加2.5ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清；
4、加1ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2～8℃ 保存；
5、理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽, 抑制劑各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不穩定，30分鐘就會降解一半，所以PMSF應該在使用前現加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩定5天。
二.各種成分在工作液中的終濃度：
Tris-HCl：50mM，pH7.4
NP-40：1%
去氧膽酸鈉：0.25%
NaCl：150mM
EDTA：1mM
PMSF：1mM
抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，抑制劑：各1μg/ml
Na3VO4：1mM
NaF：1mM
三.實驗步驟：
1、轉染后24～48h可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min，細胞裂解液于4℃，zui大轉速離心30min 后取上清；
2、取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液，4℃緩慢搖晃孵育過夜；
3、取10μl protein A瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3000rpm，離心3min；
4、將預處理過的10μl protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4℃ 緩慢搖晃孵育 2～4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；
5、免疫沉淀反應后，在4℃以3000rpm 速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3～4次；zui后加入15μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；
6、SDS-PAGE，Western blotting或質譜儀分析。
四.通過免疫共沉淀確定結合蛋白：
1、用磷酸鹽緩沖液洗30塊10cm 培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1ml冰冷的EBC 裂解緩沖液中。
2、將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上4℃ 以zui大速度離心15min。
3、收集上清（約30ml）并加入30μg的適當抗體，4℃搖動免疫沉淀物1h。
4、加入0.9ml的蛋白質A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30min。
5、用含900mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復洗5次。zui后，用NETN洗一次。
6、吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4min。
7、將樣品加入到大孔的不連續 SDS-PAGE梯度膠中，在10mA的恒定電流下電泳過夜。
8、通過考馬斯藍染色觀察蛋白質泳帶。
9、從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用1ml50% 乙腈洗兩次，每次3min。
10、用消化膠中的蛋白質，再將肽電洗脫。
11、通過窄孔液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。
五.注意事項：
1、細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質－蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100）。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％ SDS），細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。
2、使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。
3、使用對照抗體：
① 單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗
② 兔多克隆抗體：正常兔IgG
4、在免疫共沉淀實驗中要保證實驗結果的真實性，應注意以下幾點：
① 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生
② 要確保抗體的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀
③ 確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發生的，這需要進行蛋白質的定位來確定。
