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基 本 方案 1 蛋白質(zhì)或多糖抗原體內(nèi)法誘導抗體的產(chǎn)生

材 料

人外周血

類毒素混合物： 25Lf U/ml 白 喉 類 毒 素（Connaught Laboratories 或 State Laboratoriy Institute of Massachusetts) 與 IOLf U/ml 破 傷 風 類 毒 素（State Laboratoriy Institute of Massachusetts) 的混合物

多價肺炎球菌疫苗（如 Pneumovax 23、 Merck 或 Pnu-Immune 23、 Lederle)

皮下注射器和酒精棉球

1 . 采集 正 常 人 外 周 血（附 錄 3 G ) ，血凝后，離心分離血清，一 20?一 70°C 保存

2 . 用皮下注射器肌注（三頭肌或大腿肌肉）〇 .5m l 類毒素混合物，注意避開血管。注射 后 24 h 內(nèi)應密切觀察，防止過敏反應的發(fā)生（盡管少見），出現(xiàn)情況及時處理。

3 . 或者皮下注射〇 .5m l 多價肺炎球菌疫苗。注 射 后 應密切觀察，出現(xiàn)情況及時處理(曾經(jīng)接受疫苗注射的人發(fā)生過敏反應的概率增加）。

4.免疫后di 1、 2 和 3 周采血。若只采血一次，可在免疫后di 2 周采血。檢 測 IgM 時，應在免疫后di 3?7 天采血。分離血清后，血清置一 20?一 70°C 保存。

5.E L I S A 法檢測樣品中抗體的含量（見基本方案 2)。

基 本 方 案 2 ELISA 法檢測體內(nèi)抗體的產(chǎn)生

材 料

碳酸鹽緩沖液， P H 9. 6 或 PBS (見相關手冊）

抗原：白喉類毒素、破傷風類毒素、 I 或 II 型肺炎球菌多糖或蛋白質(zhì)偶聯(lián)的 III 型

肺 炎 球 菌 多 糖（見輔助方案）

NaN3，推薦使用

Tween/P B S : 含 0 •0 5 % (VTV) Tween 20 的 PBS (4 〇 C 可儲存 1 月）

含 1 % ( V A O 胎 牛 血 清（fetalcalfserum， F C S , 56°C ， Ih 滅 活 ）或含 0.1%(m /V ) B S A 的 P B S ，推薦使用

血清標準品和待測血清，避免反復凍融

F C S /Tween/P B S : 含 0.1% F C S (56°C ， Ih 滅活）的 Tween/PBS

堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase， A P ) 標記的二抗：特異性針對人抗體的 K 和入輕鏈，以及抗人 IgG、 I g A 和 IgE 抗 體（Tago)

底物，新 鮮 配 制（每 板 需 6m l 左右）

3mol/L N a O H

破傷風類毒素和白喉類毒素標準品

9 6 孔平底培養(yǎng)板及蓋子（Costar)

半自動或全自動洗板儀（Dynatech)

酶聯(lián)儀

1 . 取 9 6 孔板，預留di一列作為空白對照，在余下的每列中間隔（如 di 2、 4、 6、 8、 10列）加 入 150M1 碳 酸 鹽 緩 沖 液（檢測類毒素抗原）或 PBS (檢測多糖抗原）。

2 . 用碳酸鹽緩沖液將白喉類毒素和破傷風類毒素分別稀釋至 0. 22Lf U /m l 和 0. 56LfU /m l ; 用 P B S 將 I /I I 型肺炎球菌多糖和蛋白質(zhì)偶聯(lián)的 III 型肺炎球菌多糖分別稀釋至 0 •025m g /m l 和 1?3/^g/m l 。將稀釋的抗原各取 150^1 加入上述剩余的各縱列孔中(如di 3、 5、 7、 9、 1 1 列），置 4°C 孵育過夜。若 加 入 0 . 0 2 % N a N 3 后 ，培養(yǎng)板可保存 4 周 。

3 . 用 半 自 動 或 全 自 動 洗 板 儀 洗 板 3 次 ，每 次 加 入 200 Ml T w e en/P B S ，洗 板 間 隔 1?2 min。zui后拍干殘余的洗液。

4 . 備選操作：為降低非特異性結(jié)合，可 加 入 100? 150/xl 含 1 % F C S 或 0. 1 % B S A 的P B S 。室溫孵育 Ih (或 4°C 過夜），然 后 洗 板（檢測白喉類毒素和破傷風類毒素抗原時不需此步驟）。

5 . 將標準血清 3 倍系列稀釋，制作標準曲線。方法如下：在 di 2?3 列的di一排孔中加入 150ul zui高濃度的標準品（包括抗原包被孔和抗原未包被孔）。di 2?3 列余下的孔中加入 100ulFC S /Tween/P B S 。用多道移液器從di一排的兩孔中各吸取 50M1 血清分別加入di二排的對應兩孔中，將 血 清 進 行 3 倍稀釋。輕輕吹打混勻后，同上依次在 di 2?3 列余下的各孔中進行血清 3 倍系列稀釋。zui后，從zui末一排的兩孔中各吸

棄 50M1 稀 釋 的 血 清（此時所有孔的終體積為 lOOul)。

6 . 將成對的待測血清（免疫前和免疫后）稀釋后加到上述 9 6 孔板中。方法如下：在相應 的 2 縱 列（包括抗原包被列和抗原未包被列） zui上面的兩孔中，各 加 入 150ul 稀釋后的 待 測 血 清（通 常 1 : 4 0 , 免疫后血清稀釋度可更高些）。 2 縱列余下的各孔中加 入 IOOul F C S /Tween/P B S 。參照步驟 5 將待測血清進行 3 倍系列稀釋。

7 . 室溫孵育 2 h 或 4°C 過夜。用 Tween/P B S 洗 板 3 次 ，拍干殘余的洗液。

8 . 用 F C S /Tween/P B S 將 A P 標記的二抗稀釋至合適濃度。用多道移液器在每孔中加入 IOOul 抗 體 。di 一 列 為 空 白 對 照 ，只 加 F C S /Tween/P B S 。室 溫 孵 育 2 h 或 4°C過夜。

9 . 加 入 Tween/PBS 洗 板 3 次 ，拍干殘余的洗液。每孔中加入 IOOmI 新鮮配制的底物溶液 ，室溫顯色。酶聯(lián)儀檢測吸光值，待標準品zui高濃度孔中的 A 4q5 吸 光 值 達 1.0 時 ，在每孔中加入 lOOjul 3mol/L N aO H 終止顯色。

10 . 將數(shù)據(jù)輸入計算機，進行處理和分析。分析結(jié)果時，應將樣品孔的吸光值減去空白對照孔的吸光值。

11 . 將待測樣品的吸光值與標準品的吸光值進行比較。zhi定未稀釋標準品的抗體效價為1000 抗體單位，計算出樣品的抗體單位。zui  hao能將標準品對照國際白喉類毒素和破傷風類毒素標準品換算出國際標準值，然后計算樣品值。

輔 助 方 案 肺 炎 球 菌 多 糖 與 蛋 白 質(zhì) 的 偶 聯(lián)

III 型 肺 炎 球 菌 多 糖（和其他型肺炎球菌多糖，如 6A 、 9、 1 4 和 1 9 ) 需與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后才能穩(wěn)定地吸附于固相表面，從而獲得重復性好的實驗結(jié)果。此方法也可用于 I 和II 型肺炎球菌多糖與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)，此時，多糖抗原的劑量應減少 5?1 0 倍 。

材 料

指示液

氰尿酰氯結(jié)晶

0.1% ( m A O 多 聚 賴 氨 酸（相對分子質(zhì)量 30 000?70 000; Sigma)

III 型肺炎球菌多糖

PBS

1 . 取 3 支 試 管 ，標 記 為 A 、 B 和 C 。在 A 管 中 加 入 0.5m l 指示液•，在 B 管中加入0.5m g 氰尿酰氯結(jié)晶；在 C 管中加入 0.1 ml 0.1% (m /V ) 多聚賴氨酸。

2 . 用水將肺炎球菌多糖抗原稀釋至 l m g /m l 。在 A 管 中 加 入 0.1m l 稀釋后抗原，混勻IOs (溶液呈粉紅色）。將 A 管中的液體移入 B 管 ，混 勻 IOs ( 當 p H 降 至 8.0?8. 2 時 ，溶液變無色）。 然 后 將 B 管中的液體移入 C 管 。混勻后， 4 °C 結(jié) 合 2 h。

3 . 用 P B S 將肺炎球菌多糖抗原稀釋至 2?5 ug/ml (可 獲 得 100 Mg 偶合抗原）。