我們知道，在細胞培養檢測實驗在實驗儀器、培養基等等工作上都要耗費不少的人力和體力。好在很久以前就有高人發明了細胞保存這個實驗步驟，將暫時多出來的細胞冰凍保存，保存細胞活力。
1. 材料：
生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO (Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、0. 4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計數盤與蓋玻片、等速降溫機(KRYO10SeriesII)
2. 冷凍保存方法：
①傳統方法: 冷存管置于4 ℃10分鐘--->-20 ℃30分鐘--->-80 ℃ 16～18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。-20 ℃不可超過1小時，以防止胞內冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80 ℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
②程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3 ℃/分鐘之速度由室溫降至(-80 ℃以下)-120 ℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。
3. 步驟：
①冷凍前24-48小時更換半量或全量培養基，使細胞處于指數生長期。
②配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養基、血清，逐滴加入二甲基亞砜 (DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。
③離心收集培養之細胞，用加血清的培養基重懸起細胞，取少量細胞懸浮液(約0. 1 ml)計數細胞濃度及凍前存活率。
④取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管，制成細胞凍存懸液(DMSO后濃度為5～10%)，使細胞濃度為1～5×106cells/ ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1～2 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數、日期。然后進行凍存。
4. 注意事項：
①欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態，約為80～90%致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
②細胞在液氮中可長期凍存無*，而不會影響細胞活力;在-70度可保存數月。
③注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色(以0. 22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650)，以5～10 ml小體積分裝，4 ℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲，可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化，可換用10%甘油凍存。
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