可能原因有①一抗和二抗不匹配②沒有足夠的一抗和二抗來結合目標蛋白③封閉劑與一抗或二抗有交叉反應④一抗不識別待檢物種蛋白⑤抗原量不足⑥組織中目的蛋白含量低⑦轉膜不充分⑧洗膜過度⑨過度封閉使目標蛋白不能顯色⑩一抗失效 ?二抗受疊氮化納抑制?檢測試劑過期或底物失活。
相應的處理辦法分別是①保證二抗與一抗宿主物種相同(如一抗來自小鼠，二抗須為抗小鼠抗體)②使用高濃度抗體，4℃延長孵育時間(如過夜);③使用溫和的去污劑如吐溫-20或更換封閉劑(脫脂奶粉、BSA、明膠等);④參照況明書，比對免疫原序列和蛋白序列以確保抗體和目的蛋白會發生反應，設置陽性對照⑤保證每條泳道蛋白上樣量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制劑并設置陽性對照⑥ 濃縮樣本使信號zui大化⑦使用可逆染色劑如立春紅S檢測轉膜結果，檢查轉膜操作是否正確⑧適度洗膜⑨預實驗選擇合適的封閉劑或縮短封閉時間⑩使用新鮮抗體，重復使用有效濃度會降低?避免疊氮化餉和H盯標記抗體起使用?使用新鮮底物。
