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細胞原代培養實驗

2025年06月10日 10:44:02      來源:上海勁馬實驗設備有限公司 >> 進入該公司展臺      閱讀量:3

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  細胞原代培養可以


(1)為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段;

(2)為傳代培養創造條件;(

3)服務于臨床實踐,用于藥物篩選等。

實驗方法原理

將動物機體的各種組織從機體中取出,經各種酶(常用)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理,分散成單細胞,置合適的培養基中培養,使細胞得以生存、生長和繁殖,這一過程稱原代培養。因此,較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養,此時的細胞保持原有細胞的基本性質,如果是正常細胞,仍然保留二倍體數。但實際上,通常把*代至第十代以內的培養細胞統稱為原代細胞培養。zui常用的原代培養有組織塊培養和分散細胞培養。

實驗材料:胎鼠        新生鼠

試劑、試劑盒:1640培養基    牛血清        Hank’s液    碘酒

儀器、耗材:培養箱     培養瓶   瓶   小玻璃漏斗   平皿   吸管   移液管   紗布     血球計數板   離心機   水浴箱

實驗步驟


一、實驗材料準備

1.  Hank’s液配方:KH2PO4 0.06 g,Nacl 8.0 g,NaHCO3 0.35 g,KCl 0.4 g,葡萄糖1.0 g,Na2HPO4·H2O 0.06 g,加H2O至 1 000 ml。Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。

二、具體操作

1.  將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死,置75%酒精泡2-3秒鐘(時間不能過長、以免酒精從口和浸入體內)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠帶入超凈臺內(或將新生小鼠在超凈臺內)解剖取肝臟,置平皿中。
 
2.  用Hank’s液洗滌三次,并剔除脂肪,結締組織,血液等雜物。
 
3.  用將肝臟剪成小塊(1 mm2),再用Hank’s液洗三次,轉移至小瓶中。
 
4.  視組織塊量加入5-6倍的0.25%液,37℃中消化20-40分鐘,每隔5分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細胞分離。
 
5.  加入3-5 ml培養液以終止消化作用(或加入抑制劑)。
 
6.  靜置5-10分鐘,使未分散的組織塊下沉,取懸液加入到離心管中。
 
7.  1 000 rpm,離心10分鐘,棄上清液。
 
8.  加入Hank’s液5 ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。
 
9.  加入培養液1-2 ml(視細胞量),血球計數板計數。
 
10.  將細胞調整到5×105/ml左右,轉移至25 ml細胞培養瓶中,37℃下培養。
 
注意事項
1.  自取材開始,保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。
 
2.  在超凈臺中,組織細胞、培養液等不能暴露過久,以免溶液蒸發。
 
3.  凡在超凈臺外操作的步驟,各器皿需用蓋子或橡皮塞,以防止細菌落入。

4.  操作前要洗手,進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
 
5.  點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
 
6.  操作動作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。
 
7.  不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。
 
8.  瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
 
9.  吸溶液的吸管等不能混用。
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