全血RNA快速提取
2025年06月10日 10:00:04
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*次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量無水乙醇! 使用前將10X紅細胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到1X. 操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%,如1 ml RLT 中加入10μl β-巰基乙醇.此裂解液現用現配.配好的RLT 4℃可放置一個月.1. 在適合大小的RNase free離心管中加入1體積（<1.5 ml）加入各種抗凝劑新鮮血液="" （顛倒混勻后）和3體積的紅細胞裂解液rlb,顛倒混勻,可輕彈管壁,確保混勻.2.="" 室溫放置10分鐘（期間應該顛倒輕彈混勻數次幫助裂解紅細胞）.="" 如果rna降解嚴重,可在冰上裂解,但是時間可長一些以充分裂解.3.="" 12,000="" rpm離心20秒,倒棄紅色上清,并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細胞團）,留下完整的管底白細胞團.="" 離心后在管底應該見到白色的白細胞團,也可能有一些紅細胞殘片和白細胞團在一起,但是如果看到的是大部分的紅色細胞團,說明紅細胞裂解很不充分,應該再加入紅細胞裂解液重懸細胞團后重復步驟2,3.="" 上清盡可能的吸棄,殘留過多會稀釋裂解液,造成裂解結合異常,產量純度降低.4.=""><0.5><2x106白細胞）或者600μl（2x106-1x107白細胞）比例加rtl.5. 用帶鈍針頭的一次性="" 1="" ml（配0.9mm針頭）="" 注射器抽打裂解物="" 5-10="" 次或直到得到滿意勻漿結果（或者電動勻漿30秒）,可以剪切dna,降低粘稠度和提高產量.6.="" 較估計裂解物體積,加入等體積的70%乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,此時可能出現沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心.7.="" 立刻將混合物（每次小于700μl,多可以分兩次加入）加入一個吸附柱ra中,（吸附柱放入收集管中）13,000="" rpm離心60秒,棄掉廢液.8.="" 加700μl="" 去蛋白液rw1,室溫放置30秒,12,000rpm="" 離心30秒,棄掉廢液.="" 如果dna殘留明顯,可在加入rw1后室溫放置5分鐘再離心.9.="" 加入500μl漂洗液rw（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,12,000="" rpm="" 離心30秒,棄掉廢液.加入500μl漂洗液rw,重復一遍.10.="" 將吸附柱ra放回空收集管中,13,000="" rpm離心2分鐘,盡量除去漂洗液,="" 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應.11.="" 取出吸附柱ra,放入一個rnase="" free離心管中,根據預期rna產量在吸附膜的中間部位加30-50μl="" rnase="" free="" water（事先在="" 70-80℃水浴中加熱效果更好）,="" 室溫放置1分鐘,12,000="" rpm="" 離心1分鐘.12.="" 如果提取全血="">0.5 ml或者>2x106白細胞,加30-50μl RNase free water重復步驟11,合并兩次洗脫液,或者使用*次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍（如果需要RNA濃度高）. 洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產量比前者高15–30%,但是濃度要低,用戶根據需要選擇.
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